全反式视黄酸对神经干细胞诱导分化和c-myc基因表达的调控

目的:观察全反式视黄酸对神经干细胞的诱导分化情况,及其对c-myc基因、蛋白表达的影响。方法:实验于2005-03/06在南方医科大学高温医学研究室完成。①基础培养液:DMEM/F12中含Hepes15mmol/L,NaHCO32g/L,2?7,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素。神经干细胞培养液:基础培养液 碱性成纤维细胞生长因子20μg/L。神经干细胞分化诱导培养液:基础培养液 体积分数为0.01的胎牛血清。全反式视黄酸储备液:以二甲基亚砜为溶剂,配成浓度为1.0×10-3mol/L全反式视黄酸储备液。②出生2～3d SD大鼠6只,麻醉后开颅取出全脑,机械分离结合无血清培养基进行鼠纹状体神经干细胞的分离培养,取生长状态良好的第3代细胞用于实验。③将神经干细胞克隆接种于12孔培养板中,全反式视黄酸组加入神经干细胞分化诱导培养液 不同浓度全反式视黄酸(0.01,0.1,1.0,10.0μmol/L)。二甲基亚砜对照组加入神经干细胞分化诱导培养液 0.01%二甲基亚砜。各组细胞培养7d后进行免疫组织化学染色鉴定,计数神经元样细胞分化率。RT-PCR分析c-myc基因表达情况,Western blots检测c-myc蛋白的表达。结果:①神经干细胞的原代和传代培养与鉴定:来源于新生大鼠纹状体组织的原代克隆和传代克隆,呈巢蛋白抗原阳性。第3代细胞加入含不同浓度全反式视黄酸的神经干细胞分化诱导培养液,呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白抗原阳性。②全反式视黄酸对神经干细胞分化的影响:随着全反式视黄酸浓度(0.01,0.1,1.0,10.0μmol/L)升高,神经元样细胞分化率逐渐增加(F=358.59,P=0.000)。全反式视黄酸浓度为1.0,10.0μmol/L时神经元样细胞分化率基本相似(34.27±0.81)%,(35.27±0.32)%,P=0.163]。③全反式视黄酸对c-myc基因及其蛋白表达的影响:随着全反式视黄酸作用时间的增加,与二甲基亚砜对照组相比,全反式视黄酸组的c-myc mRNA表达下调(F=20.891,P=0.000),c-myc蛋白表达亦下调(F=43.138,P=0.000)。结论:生理浓度(1.0μmol/L)的全反式视黄酸是诱导神经干细胞向神经元方向分化的适宜剂量。全反式视黄酸可能通过细胞周期调控因子c-myc从而影响神经干细胞的增殖分化。

Effects of all-trans retinoic acid on the differentiation of neural stem cells and the expression of c-myc gene