骨髓基质细胞与pLXSN-bcl-2基因联合治疗大鼠脑缺血

目的:用质粒pLXSN携带抗凋亡基因bcl-2,观察分析骨髓基质细胞与其联合应用对局灶性脑缺血大鼠的治疗效果。方法:实验于2005-05/2006-10在中国医科大学完成。①实验材料:雌性Wistar大鼠40只,随机数字表法分为模型对照组、细胞移植组、基因质粒组、联合组,10只/组。另选取雄性Wistar大鼠10只用于骨髓基质细胞的提取。质粒pLXSN-bcl-2由钱其军博士惠赠。②实验方法:无菌条件下取大鼠肱骨、胫骨和股骨,去除干骺端,冲出骨髓,离心后重悬为单细胞悬液进行原代培养。待细胞生长到80%铺满瓶底时胰蛋白酶消化,接种密度1×104/cm2,传至3代后用于细胞移植,移植前24h行BrdU标记。扩增、提取、鉴定并纯化pLXSN-bcl-2质粒,-20℃备用。各组均采用改良线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型。质粒于造模后3h经鼠颈动脉注入,总量为10μg,总体积200μL。骨髓基质细胞于造模后24h经鼠尾静脉注入,总量为3×106个,总体积1mL。模型对照组给予等量生理盐水。③实验评估:各组大鼠分别于移植术后3,14d清醒状态下进行神经运动功能评分。麻醉后处死,免疫组织化学法观察脑源性神经营养因子及Bcl-2蛋白的表达、BrdU标记的骨髓基质细胞在脑内的分布及数量,TUNEL法检测脑内细胞凋亡情况。结果:①神经功能评分:移植术后3d联合组神经功能评分明显小于模型对照组,至14d明显低于其余各组(P<0.05)。②移植入脑的Brdu阳性骨髓基质细胞数:联合组和细胞移植组在梗死半球可见大量BrdU阳性的骨髓基质细胞,主要存在于梗死灶周边,其次为海马、纹状体区,梗死对侧也有少量细胞存在。移植术后3,14d,联合组Brdu阳性细胞数均明显多于细胞移植组(P<0.05)。③脑源性神经营养因子及Bcl-2蛋白的表达:移植术后3,14d,联合组脑源性神经营养因子、Bcl-2蛋白的表达均明显高于其余3组(P<0.05)。④细胞凋亡情况:移植术后3,14d,联合组细胞凋亡数量均低于其余各组(P<0.05)。结论:骨髓基质细胞与pLXSN-bcl-2两种治疗因素叠加应用可明显改善大鼠缺血性脑损伤,且效果优于其各自的单独作用。其机制可能是bcl-2基因在抗脑内细胞凋亡的同时,也抑制移植入脑的骨髓基质细胞凋亡,从而更大限度发挥骨髓基质细胞的治疗作用。

Effect of bone marrow stromal cells combined with pLXSN-bcl-2 gene on rat cerebral ischemia