| 湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶全长基因克隆、表达与蛋白活性分析 |
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| 引用本文： | 马宪亮,刘琴,张仪. 湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶全长基因克隆、表达与蛋白活性分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2012, 0(4): 262-267 |
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| 作者姓名： | 马宪亮 刘琴 张仪 |
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| 作者单位： | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室,世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心 |
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| 基金项目： | 国家传染病科技重大专项(No.2012ZX10004220);上海市自然科学基金(No.10ZR1433400)~~ |
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| 摘 要： | 目的克隆湖北钉螺(Oncomelania hupensis)硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)全长基因cDNA,并分析其表达蛋白的抗氧化活性。方法抽提人工饲养的阴性湖北钉螺总RNA,采用逆转录PCR方法扩增TPx基因片段。使用快速扩增cDNA末端法(RACE)扩增TPx基因,获得全长基因cDNA,与质粒pGEM-Teasy连接后,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选、测序,并进行生物信息学分析。克隆质粒pGEM-Teasy/TPx和表达载体pET28a经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET28a/TPx,转入E.coli BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,通过组蛋白标签镍离子(Ni-NTA)层析柱分离纯化可溶性蛋白。在体外过氧化氢(H2O2)还原试验中,分别加入不同浓度的TPx重组蛋白(10、20、30、40和50μg/ml),各浓度均设二硫苏糖醇(DTT)平行对照,计算H2O2清除率。在DNA超螺旋保护试验中,分别加入2.5、5.0和10μg/ml重组蛋白,观察其对DNA超螺旋结构的保护作用。结果 TPx全长基因cDNA为992bp,开放阅读框(ORF)为747bp,GenBank登录号为JN831437,编码249个氨基酸,预期蛋白相对分子质量(Mr)为27 000。重组质粒pET28a/TPx构建成功,经诱导表达和纯化后获得了可溶性重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,Mr为27000。体外H2O2还原试验结果显示,含有DTT的反应体系H2O2清除率均显著高于不含DTT的体系(均P<0.05),各个浓度组间差异无统计学意义(均P>0.05)。DNA超螺旋保护试验结果显示,5.0μg/ml组保护效果优于2.5μg/ml组,但5.0μg/ml组和10μg/ml组的保护效果差异不明显。结论获得湖北钉螺TPx全长基因cDNA,且重组表达蛋白具有一定抗氧化功能。
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| 关 键 词： | 湖北钉螺 硫氧还蛋白过氧化物酶 克隆 表达 |
Cloning,Expression and Activity Analysis of Full-length Gene Encoding Thioredoxin Peroxidase from Oncomelania hupensis |
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| MA Xian-liang,LIU Qin,ZHANG Yi. Cloning,Expression and Activity Analysis of Full-length Gene Encoding Thioredoxin Peroxidase from Oncomelania hupensis[J]. Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 2012, 0(4): 262-267 |
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| Authors: | MA Xian-liang LIU Qin ZHANG Yi |
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| Affiliation: | (National Institute of Parasitic Diseases,Chinese Center for Disease Control and Prevention;Key Laboratory of Parasite and Vector Biology,MOH;WHO Collaborating Centre of Malaria,Schistosomiasis and Filarasis,Shanghai 200025,China) |
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