大鼠opticin表达基因小发夹RNA真核表达质粒的构建及鉴定

　　目的　构建针对大鼠opticin表达基因(OPTC)的特异性小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒。方法　用DNA重组技术将针对大鼠OPTC基因不同位点所设计的4个shRNA序列克隆到真核表达质粒中。根据构建的4对质粒设置shRNA-1组、shRNA-2组、shRNA-3组、shRNA-4组,同时只加转染试剂不加质粒的细胞设为正常对照组,转染阴性质粒的细胞为阴性对照组。用脂质体lipofectimine 2000将4个shRNA质粒分别转染至体外培养的原代大鼠睫状体非色素上皮(NPE)细胞,转染后采用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测OPTC基因的mRNA及opticin蛋白的相对表达量和抑制率。结果　各组质粒转染大鼠NPE细胞后,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4组细胞OPTC mRNA相对表达较正常对照组均明显下调(F=10.239,P＝0.000),各组OPTC mRNA抑制率为85.7%、62.87%、54.87%、48.77%。各质粒干扰组细胞opticin蛋白表达较正常组均有不同程度下降(F=17.870,P=0.000),各组opticin蛋白抑制率为78.7%、34.6%、31.1%、16.8%。结论　OPTC基因干扰质粒shRNA-1可以有效抑制大鼠睫状体NPE细胞opticin的表达。

Construction and identification of small hairpin RNA expression plasmid targeting opticin gene in rat