大鼠Atoh1基因真核表达载体的构建及转染293T细胞的实验研究

摘要：目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因CDS，构建大鼠核转录因子Atoh1的真核表达载体并在真核细胞
中表达。方法从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA，采用逆转录PCR法扩增Atoh1基因CDS区序列并TA克隆至PMD-19T
载体中。测序鉴定后将Atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点（internal ribosome entrysite, IRES）的真核细
胞表达载体pIRES2-EGFP中，对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后，以脂质体介导法转染至293T细胞，荧光显微镜、
PT-PCR和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果扩增得到大鼠Atoh1 CDS区长1056 bp，编码351个氨基酸，
与GeneBank公布的参考序列对比，有两处碱基发生突变，但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致，两处碱基
应为单核苷酸多态性（SNP），突变为无义突变，不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达
载体pIRES2-EGFP中，转染293T细胞48 h后，荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达，PT-PCR和Western blot证实Atoh1
的mRNA和蛋白能在293T细胞中正确表达。结论成功构建了真核表达载体pAtoh1 -IRES2-EGFP，并在293T细胞中成
功表达，为进一步研究Atoh1的功能、作用机制及感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。

Construction of a recombinant eukaryotic vector of Atoh1 and its expression in 293-T cells

Objective To clone the coding sequence of Atoh1 cDNA from SD rat and construct a eukaryotic expression vector for its expression in eukaryotic cells.Methods The total RNA was extracted from colonic mucosa of SD rats and the double-stranded cDNA of Atoh1 was amplified using RT-PCR.The cDNA coding sequence was then cloned into PMD-19T vector followed by sequence analysis.The digested fragment,after purification,was linked into the eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP containing the EGFP gene and the inter...