K_(ATP)通道Kir6.2亚基点突变体Kir6.2AAA在大鼠心肌细胞中的表达

目的制备含K ATP通道亚基点突变的重组腺病毒,并将其在大鼠心肌细胞中表达。方法针对Kir6.2位点的引物,利用Overlap PCR的方法定点突变Kir6.2的GFG氨基酸变成AAA,并将其克隆到pShuttle载体中进行序列分析,经PmeⅠ线性化、连接到腺病毒表达载体pAdEasy-1中,将pAdEasy-1包装进脂质体、转染入大鼠原代心肌细胞,并利用反转录PCR和Western blot法进行检测。结果成功制备了携带大鼠Kir6.2AAA及EGFP基因的重组腺病毒,病毒的滴度为2.64×1011VP/mL。荧光显微镜下可见Kir6.2AAA重组体腺病毒感染后的大鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光,反转录PCR证实重组腺病毒载体Ad-Kir6.2AAA感染的心肌细胞中Kir6.2AAA的表达显著上调,Western blot法证明Kir6.2AAA在大鼠心肌细胞中过表达。结论成功构建了携带EGFP基因的Kir6.2AAA重组腺病毒载体并将其在大鼠心肌细胞中正确表达。