华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析 |
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引用本文: | 吴德,吴忠道,胡旭初,何东苟,黄艳,余新炳.华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析[J].中国寄生虫病防治杂志,2005,18(1):28-32. |
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作者姓名: | 吴德 吴忠道 胡旭初 何东苟 黄艳 余新炳 |
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摘 要: | 目的 通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库,寻找、识别新基因,并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中,表达出融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础。方法用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增,对产物为500bp以上的质粒进行测序,测序结果在NCBI和ExPasy,网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据pGEX-4T-1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA编码序列设计引物,进行PCR扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体pGEx-4T-1上。构建的重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,并对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定。结果 发现CsGAPDH基因,完整阅读框含1017个碱基对,编码339个氨基酸,理论分子质量单位为37.02409ku,理论pI为6.66。序列分析显示,CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78%,具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS-PAGE电泳显示表达产物在63ku处有1条特异性条带。结论 发现华支睾吸虫GAPDH基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。
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关 键 词: | 华支睾吸虫 磷酸甘油醛脱氢酶 克隆 原核表达 序列分析 |
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