| 摘 要： | 目的构建PETA-3/CD151shRNA慢病毒表达载体,并在人乳腺癌细胞株MCF-7细胞鉴定其转染及基因沉默效果。方法应用基因工程技术,构建4条针对PETA-3基因的RNAi靶序列,分别与慢病毒载体Pg LV3连接,构建重组慢病毒表达载体PETA-3-shRNA-1~4;将连接产物转化到Top10感受态细胞,经筛选阳性克隆、测序鉴定。应用脂质体法转染293FT细胞,进行病毒包装及滴度测定。将包装产生的4种重组慢病毒分别感染MCF-7细胞,实时定量PCR和Western印迹检测MCF-7细胞PETA-3 mRNA和蛋白的表达。根据筛选的结果,选取最有效的载体进行病毒的大量包装。结果 4个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,感染MCF-7细胞96 h后,PETA-3-shRNA-2 mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降,其中mRNA表达下降85%,蛋白表达下降84%(均P<0.05)。shRNA-2病毒载体大量包装后其滴度为1×109TU/ml。结论成功构建针对PETA-3基因的慢病毒载体PETA-3-RNAi-LV3,体外感染MCF-7细胞后可有效抑制PETA-3基因和蛋白的表达。
|
