应用体外扩增法对兔骨髓来源内皮祖细胞的分离培养和鉴定

目的拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步研究自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础.方法实验于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成.①DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白(molecular probes公司),FITC标记的凝结素BS-1(vector公司),鼠抗人CD34抗体(Biolegend公司),兔抗人Flk-1抗体(Biolegeng公司),鼠抗人CD133单抗(R&D公司).②选用新西兰大白兔8只,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞.接种密度为1×106/cm2,加入含有血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子的M199培养基中体外扩增培养7 d,观察细胞生长情况及增殖能力.③通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光.④免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,Flk-1 的表达.结果(①细胞形态观察新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72 h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞.②血管内皮祖细胞的增髓能力培养2～4 d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线呈典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23.③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果在血管内皮祖细 胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上;与凝集素BS-1结合率几乎达100%;二者双染色率达90%以上.④血管内皮祖细胞免疫组化及流式细胞仪检测结果细胞表面标志物CD133,Flk-1,CD34均呈阳性.结论体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体.

Isolation,cultivation and identification of endothelial progenitor cells from rabbit bone marrow by in vitro amplification method