肝细胞癌中促癌miRNA调控网络分析与验证

目的构建肝细胞癌中生存相关的促癌miRNA与其靶基因的调控网络并对关键miRNA-靶基因进行实验验证。方法利用OncomiR和Oncolnc获取肝癌中生存相关的miRNA，并进行表达分析和生存分析；利用miRNet预测miRNA的靶基因，通过GEPIA2、Ualcan分别对靶基因进行生存和表达分析，通过Starbase进行miRNA-靶基因共表达分析，利用Cytoscape软件构建miRNA-靶基因网络，通过Enrichr进行靶基因富集分析，利用String数据库进行蛋白互作网络构建。将NC，hsa-miR-1226-3p的mimic或inhibitor，hsa-miR-221-5p的mimic或inhibitor分别转染HepG2细胞，利用CCK8检测转染后细胞活力的变化情况，另取转染后48 h样品利用Q-PCR检测靶基因表达情况；将NC，hsa-miR-221-5p的mimic或inhibitor分别转染HepG2细胞，48 h后用Werstern blot检测靶基因蛋白表达情况；将NC+p-GCDH-WT质粒，NC+p-GCDH-MUT质粒，hsa-miR-221-5p mimic+pGCDH-WT质粒，hsa-miR-221-5p mimic+p-GCDH-MUT质粒分别转染HepG2细胞，48 h后利用多功能酶标仪检测荧光素酶活性；将NC，hsa-miR-221-5p mimic，pEGFP N1-GCDH质粒，hsa-miR-221-5p mimic+pEGFP N1-GCDH质粒分别转染HepG2细胞，利用CCK8检测转染后细胞活力的变化情况，transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果从OncomiR和Oncolnc数据库中分别得到223个（P < 0.05）和146个（P < 0.05）在肝癌中与生存相关的miRNA，两者交集为131个；结合表达分析和生存分析的结果共鉴定出48个促癌miRNA；miRnet共预测出10 278个靶基因，通过生存和表达分析符合预期的为44个，miRNAmRNA共表达分析后的结果显示27个靶基因符合预期。通过Cytoscape软件构建的miRNA-靶基因网络包含了25个促癌miRNA和27个抑癌基因。富集分析结果显示靶基因集中作用于脂肪酸代谢通路。验证实验显示，转染hsa-miR-1226-3p的mimic和inhibitor，hsa-miR-221-5p的mimic和inhibitor后，其对应的靶基因mRNA或蛋白水平均显著改变（P < 0.05）；hsa-miR- 221-5p mimic和p-GCDH-WT质粒共转可显著降低其荧光素酶的活性（P < 0.05）；pEGFP N1-GCDH质粒和hsa-miR-221-5p mimic共转可显著恢复其对细胞活力，以及细胞迁移、侵袭能力的影响（P < 0.05）。结论通过综合分析鉴定了肝癌中的促癌miRNA并构建了其调控网络；脂肪酸代谢可能是肝细胞癌中促癌miRNA发挥作用的重要的靶标信号通路之一。hsa-miR-221- 5p/GCDH轴是肝癌进展的重要分子机制。