小鼠可溶性PD-1的克隆、原核表达及活性分析

目的：小鼠可溶性PD-1（sPD-1）原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法：应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆sPD-1基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-sPD-1,转化至E.coliDH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-sPD-1转化至E.coliBL21（DE3）中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-sPD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的sPD-1融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果：成功构建重组质粒pGEX-4T-1-sPD-1,并在E.coli BL21（DE3）中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-sPD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论：成功地克隆、表达和纯化了小鼠sPD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴细胞增殖,为进一步研究其功能和临床应用提供了条件。