1,3-O,N螺杂环类乙酰肝素酶抑制剂对子宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用

目的：通过观察乙酰肝素酶（HPA）抑制剂对子宫颈癌HeLa细胞体外生长的抑制作用及HPA表达的影响，为子宫颈癌HPA分子靶向治疗提供理论依据。方法优化设计并合成了两个系列共13种1，3-O，N螺杂环类化合物，产品编号为10～22号，其中21号为HPA抑制剂——DMBO化合物，余12种为新合成的化合物。其中，1个系列含甲氧苯基，产品编号为10～14号；另1个系列不含甲氧苯基，产品编号为15～22号。（1）采用乙酰肝素降解检测试剂盒检测新合成的化合物（选择与DMBO结构类似度高的6个化合物，即14、15、16、20、21、22号化合物）对HPA活性的作用，以50%抑制浓度（IC50）表示作用的强弱；（2）四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测新合成的化合物（7个化合物，即11、12、14、15、16、20、22号化合物）作用后HeLa细胞生长的抑制作用，选择抑制作用最大的化合物（即16号化合物）用于以下实验；（3）细胞划痕实验观察16号化合物作用后HeLa细胞迁移能力的变化；（4）流式细胞仪检测16号化合物作用后HeLa细胞的细胞周期比例和细胞凋亡率的变化；（5）实时定量逆转录（RT）-PCR技术、蛋白印迹法和免疫组化法检测16号化合物作用后HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白表达的变化。结果（1）6个新合成的化合物（即14、15、16、20、21、22号化合物）对HPA活性均有不同程度的抑制作用，除22号化合物抑制作用不明显无法测出IC50值外，14、15、16、20、21号化合物的IC50值分别为4.47、21.81、8.36、14.13、47.19μmol/L。（2）MTT比色法检测显示，不同浓度（分别为1、5、15、30、60、120、180、240μmol/L）的7个新合成的化合物（即11、12、14、15、16、20、22号化合物）作用48 h对HeLa细胞的生长均有抑制作用，并呈明显的浓度依赖性（P<0.01），其中16号化合物的抑制效果最显著（IC50值为48.16μmol/L）；进一步检测显示，16号化合物作用不同时间（分别为24、48、72、96 h）后对HeLa细胞生长的抑制作用呈明显的时间依赖性（P<0.01）。（3）细胞划痕实验观察显示，作用24 h后，实验组（加入50μmol/L的16号化合物，下同）HeLa细胞迁移能力明显受到抑制，其划痕的宽度明显大于对照组（不加16号化合物，下同）。（4）流式细胞仪检测显示，作用48 h后，实验组HeLa细胞G0/G1期、G2/M期比例分别为（75.85±1.77）%、（11.65±0.64）%，均明显高于对照组[分别为（49.10±3.11）%、（0.17±0.24）%；P<0.01]；S期细胞比例为（12.50±1.13）%，明显低于对照组的（50.70±2.83）%（P=0.003）。实验组HeLa细胞的凋亡率为（11.9±1.2）%，明显高于对照组的（6.6±1.8）%（P=0.013）。（5）实时定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测显示，作用48 h后，实验组HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白的表达水平分别为1.23±0.46和0.46±0.31，明显低于对照组的3.43±0.45和1.30±0.58（P<0.05）；免疫组化法检测显示，实验组累积吸光度（IA）值为0.39±0.04，对照组为0.50±0.09，两组比较，差异有统计学意义（P=0.026）。结论新型1，3-O，N螺杂环类HPA抑制剂可能通过凋亡途径显著抑制子宫颈癌HeLa细胞的生长；该类抑制剂可明显抑制HeLa细胞的HPA活性，并下调其HPA mRNA和蛋白的表达。

Effect of 1,3-O,N spiroheterocyclic inhibitors of heparanase on the growth of HeLa cells