广西南宁地区片形吸虫的分子鉴定及遗传多态性分析北大核心CSCD

目的基于核糖体内转录间隔区(ITS+,包括ITS1、5.8S和ITS2及其侧翼序列)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅰ(NADⅠ)、线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)序列和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(pepck)多重PCR初步鉴定广西南宁地区采集的片形吸虫的种类。方法于南宁市某屠宰场采集11头感染片形吸虫的牛肝脏,分离片形吸虫成虫,并孵育获得虫卵。提取片形吸虫成虫的基因组DNA,PCR扩增ITS+、NADⅠ和COXⅠ序列并测序,所得序列经BLAST在线工具进行比对,并结合pepck基因多重PCR鉴定虫种;提取部分片形吸虫的虫卵基因组DNA,PCR扩增ITS+序列并测序;采用BioEdit软件进行多序列比对,分析片形吸虫亲代及子一代的遗传变异情况。结果共获得151条片形吸虫成虫,ITS+序列扩增产物长964bp,仅NN20-2为Fh型,与GenBank中瑞士肝片形吸虫(登录号:MK321602)的同源性为100%;NN17-11、NN20-9和NN20-14携带巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重序列特征,属于Fg/Fh杂合型,序列图谱上特定变异位点出现双峰,个体间双峰比值存在明显差异,NN17-11为Fg∶Fh=1∶1,NN20-9和NN20-14为Fg∶Fh=1∶5;其余147个样本是Fg型,可细分为19个亚型,其中NN4-1等100个虫体与GenBank中越南巨片形吸虫(登录号:MN970009)的同源性为100%,其余虫体中共出现14个变异位点,多为双峰。线粒体基因NADⅠ和COXⅠ序列扩增产物长度分别为535bp和438bp,分别有34、22个变异位点,细分为28、21种单倍型,所有虫体的NADⅠ和COXⅠ均属于巨片形吸虫类群。pepck PCR产物电泳显示NN17-11、NN20-2、NN20-9和NN20-14等4个虫体出现巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重条带,其它样本只有巨片形吸虫的单条带。虫卵的ITS+序列结果显示,ITS-Fh型片形吸虫NN20-2成虫有1个虫卵(1/30)转变为Fg/Fh型;巨片形吸虫NN20-3成虫有5个虫卵(5/30)呈现Fg/Fh型,其余虫卵与母体基本一致。结论广西南宁地区片形吸虫种群以纯种巨片形吸虫为主,同时存在少量杂合型片形吸虫。