基于塔姆德病毒NP蛋白间接ELISA方法的建立北大核心CSCD

目的原核表达和纯化Tamdy病毒(TAMV)核蛋白(NP),以此为抗原建立间接ELISA方法,以期用于TAMV感染血清流行病学调查。方法采用PCR法扩增NP基因,构建重组质粒(pET-32a-NP)并转化至E.coli BL21中诱导表达NP蛋白,15%SDS-PAGE鉴定和镍柱亲和层析纯化重组NP蛋白,以TAMV阳性羊血清为一抗,采用ELISA检测其抗原性。以纯化的pET-32a-rNP作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立检测TAMV血清抗体的间接ELSIA方法,评价其重复性、敏感性和特异性。检测采自新疆部分地区动物血清,采用建立的ELISA方法检测TAMV抗体。结果成功构建pET-32a-NP重组质粒和表达菌株pET-32a-rNP,重组蛋白大小约为72 ku并具有反应原性;ELISA优化试验确定的最佳包被浓度为4μg/ml、封闭液浓度为3%、血清稀释度为1∶100、血清孵育时间为100 min,酶标抗体稀释度为1∶3000,TMB显色时间为6 min;通过检测30份阴性样品确定临界值,当样品吸光充A450值≥0.268时判定为阳性;重复性试验结果表明,批内和批间变异系数(CV)<10%。敏感性试验表明,阳性血清稀释度达1∶600,具有良好的敏感性。特异性试验表明,该方法不与GTV、CCHFV和SFTSV发生交叉反应。取464份采自新疆不同地区的羊、狗和鼠血清标本进行ELISA检测,检出TAMV阳性血清68份,阳性率14.66%。结论建立的检测TAMV血清抗体的间接ELISA方法敏感、特异,且重复性良好,可用于TAMV的血清流行病学调查。