新生大鼠海马区神经干细胞分离培养和单细胞克隆系建立及鉴定

目的:分离培养新生大鼠海马区神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),建立NSCs单细胞克隆系。方法:取新生SD大鼠海马组织分离NSCs后无血清技术培养,建立其克隆系并行单细胞传代克隆培养。采用细胞免疫荧光和RT-PCR等技术对NSCs进行鉴定,分子标志物选择Nestin和Sox2。NSCs诱导分化的神经元的鉴定,标示物选择早期神经元特异性微管蛋白(β-tubulin),星形胶质细胞标示物为特异性胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),少突胶质细胞特异性标记蛋白为髓鞘相关蛋白(cyclic nucleotide phosphodiesterase,CNP)。结果:无血清培养法可维持NSCs生长和促进其增殖。成功建立NSCs单细胞克隆系,传代可获得大量亚克隆NSCs株团。单细胞克隆NSCs球团经早期酶消化结合后期机械吹打法传代,分散为单细胞或类单细胞后,增殖及分化能力依然存在。单细胞克隆系株经Nestin和Sox2细胞免疫荧光或RT-PCR检测均为阳性表达。在加有胎牛血清培养基条件下进行诱导分化,来自单细胞克隆系的细胞株同样可分化为神经元样、星形胶质细胞样和少突胶质细胞样3种神经细胞,即β-tubulin、GFAP、CNP免疫荧光染色分别呈阳性。结论:无血清培养可成功建立新生SD大鼠海马区NSCs单细胞克隆系,并可稳定传代增殖,并在一定条件下可诱导分化为成熟的神经元和神经胶质细胞。