Pseudomonas putida ND6中萘降解调控基因nahR突变株的构建及萘降解调控机制初探

【目的】构建Pseudomonas putida ND6中双拷贝萘降解调控基因nahR突变株,初步探讨ND6菌株的萘降解调控模式。【方法】扩增nahR基因的上下游同源片段及卡那霉素抗性基因Km;利用重叠延伸PCR技术将这三个片段连接起来,然后将其克隆到自杀性载体pEX18Tc,得到同源重组载体pEX18Tc-RKm;采用热激法将同源重组载体pEX18Tc-RKm转化到供体菌Escherichia coli S17-1,再利用接合转移的方法将供体菌中的载体转到受体细菌ND6菌株,通过同源重组敲除nahR基因,对突变菌株进行nahR基因调控分析。【结果】成功获得了nahR基因突变株。以萘为唯一碳源的无机盐培养基中,突变株生长明显比野生型延迟;以水杨酸钠为唯一碳源的无机盐培养基中,突变株与野生株生长曲线并无明显差异。以葡萄糖为唯一碳源培养时,野生型ND6中的nahR基因有一定量的本底表达量,加入诱导物水杨酸钠后,其表达水平没有明显的变化。【结论】本研究为深入研究ND6菌株萘降解操纵子调控机制奠定了基础。通过对突变株和野生型的比较研究,我们发现ND6菌株中的萘降解上游操纵子受到NahR蛋白的调控,而下游操纵子不受NahR蛋白的调控,且nahR基因为组成型表达。

Construction of a nahR Gene Knock-out Mutant of Pseudomonas putida ND6 and Exploration of the Regulation Mechanism