异硫氰酸荧光素标记动态观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞的损伤

目的:应用异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白,在激光共聚焦显微镜下直接观察天花粉蛋白进入黑色素瘤B16细胞的动态过程并分析其对黑色瘤B16细胞的损伤作用。方法:实验于2003-08/2004-08在南通大学神经再生重点实验室完成。将常规传代培养的黑色素瘤B16细胞用胰酶消化,以5×109个/L的浓度种植于24孔培养板。将天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白分别加入培养细胞中,终浓度为50mg/L,同时加入等量生理盐水作为正常对照组,每组再分别设3,6,12h不同孵育时间组。异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白后,利用激光共聚焦显微镜观察异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白进入细胞的过程及其荧光强度,CCK-8细胞毒性实验评估各组细胞存活率、并用单细胞凝胶电泳及hoechst33258染核观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞致DNA损伤作用。结果:①终浓度50mg/L的异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白孵育3h时已经进入黑色素瘤细胞,6h时进入细胞量达到最高,12h时已轻度下降,各时间点比较差异有统计学意义(P<0.01)。异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白组与异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白组荧光强度差异有显著性(P<0.01)。②终浓度50mg/L异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、天花粉蛋白孵育黑色素瘤细胞3,6h后利用单细胞电泳和Hoechst33258染色未观察到核形态的变化;但孵育6h后CCK-8细胞毒性实验显示活细胞数量明显下降;孵育12h后出现DNA损伤的特征性彗星尾现象,并观察到明显的核浓缩和边集现象,出现特征性凋亡小体。结论:孵育6h时天花粉蛋白进入细胞量最多,但并没有明显的细胞DNA损伤的作用,而孵育12h时产生明显的细胞毒作用和凋亡的发生。

Damage of fluorescein isothiocyanate labeled-trichosanthin to melanoma B-16 cells: A dynamic observation