靶向TNF-α基因shRNA干扰片段的筛选和重组体的构建

本研究利用RNA干扰技术，筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的小发夹状RNA（shRNA）片段，设计并构建重组质粒，进行序列分析，为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径。取原代培养小鼠腹腔巨噬细胞，置于15％ DMEM中，调细胞浓度为2×10^7／L，接种于6孔板，3ml／well；细胞用脂多糖（LPS）激活，ELISA法测不同时间培养上清中TNF—α的浓度；将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后，与转染试剂混合转染入巨噬细胞，细胞用LPS激活24小时后用ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度，RT—PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达；将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段插入质粒载体，转化Ecoli DH5α感受态菌株，提取质粒，进行测序分析。结果表明：LPS刺激巨噬细胞24小时后，细胞分泌TNF—α达高峰；转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF—α浓度与对照组相比下降最明显（P〈0．05），达59．46％，TNF—α mRNA的表达被抑制了61．2％；将干扰序列1DNA序列克隆到载体上，经测序鉴定确实为所需序列。结论：成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建重组质粒，可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-α mRNA的表达，为TNF—α相关疾病的基因治疗提供新手段。

Screening of Effective shRNA Targeting TNF-α and Constructing of Recombinant Plasmid