抗p185单抗5E12Fab段基因的克隆及表达

目的：克隆抗p185单抗5E12的Fab段基因并在原核细胞进行表达。方法：用逆转录．聚合酶链反应技术（RT-PER），以可变区第一骨架区的通用引物从分泌抗p185单抗的杂交瘤细胞系5E12中克隆Fd段和K链的基因，重组到Fab表达载体中，在大肠杆菌中表达噬菌体抗体和可溶性Fab；根据前导肽序列设计引物，通过PER介导的定点突变将V区基因氨基端序列恢复为5E12的原始序列；以NIH3T3／erbB-2细胞ELISA法、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果：以第一骨架区的通用引物从小鼠杂交瘤细胞5E12中克隆到Fd段和k链的基因，在大肠杆菌中表达出Fab段抗体但无特异性抗原结合活性，分别将Fd段和k链V区基因的氨基端序列矫正为亲本单抗的原始序列后，恢复了Fab段的抗原结合活性。单独恢复Fd段可变区氨基端序列可恢复抗原结合活性。但同时恢复k链后活性却有所下降。结论：成功构建了抗p185小分子抗体Fab并进行功能性表达，为进一步构建抗p185鼠单抗其他小分子抗体及其人源化改造打下基础；进一步证实抗体氨基端序列对抗体活性的重要性，为今后以PER方法构建小分子抗体的工作提供了有益的借鉴。

Cloning and expression of Fab gene of anti-p185 monoclonal antibody