基因转运载体中甲基化XbaⅠ位点的体外克隆与应用

目的探讨基因转运载体中甲基化XbaⅠ位点在基因克隆中的效用。方法以pIRES2-EGFP为母本,PCR扩增获得携附加XhoⅠ位点和满足甲基化序列组成的XbaⅠ位点、同时缺失IRES和EGFP区段的载体骨架pΔSG,其PCR产物与携带对等酶切位点的EGFP PCR产物经酶切、连接后,构建重组质粒rpΔSG-EGFPV-Xho、rpΔSG-EGFPV-Xba。另将pΔSG和EGFP的PCR产物分别与pMD 18-T Simple T载体连接,构建重组质粒psT-ΔSG和psT-EGFP,并亚克隆获得重组质粒rpΔSG-sT-EGFPV-Xho。以DsRed2基因置换rpΔSG-sT-EGFPV-Xho中的EGFP基因,获得重组质粒rpΔSG-sT-DsRed2V-Xho。各重组质粒经脂质体介导转染CHO细胞。结果各重组质粒转染的细胞中明显可见EGFP或DsRed2的高效表达。结论 PCR产物中满足甲基化序列组成的XbaⅠ位点,在体外酶切与连接的克隆效果良好;该序列经体外重组并导入Dam+和/或Dcm+宿主菌中扩增时被重新甲基化而受保护,且对重组质粒在宿主细胞内的稳定性和生物活性没有明显影响。