半胱氨酸蛋白酶3在局灶性脑缺血再灌注损伤皮质中的动态时空表达

目的:观察半胱氨酸蛋白酶3在局灶性脑缺血再灌注不同时间、灶周皮质的动态时空变化。方法:实验于2005-05/08在河北医科大学第二医院神经分子影像医学和神经病学实验室完成。①选择清洁级健康新西兰白兔66只,雄性,兔龄4.5～5个月,体质量(2.6±0.2)kg,采用兔大脑中动脉阻断局灶性脑缺血再灌注模型,随机分为假手术组(n=6),模型组(n=60),模型组按再灌注时间又分为6个时间点,即1h、6h、1d、3d、7d、14d,每个时间点10只大白兔,各时间点依方法不同又分为组织学检测组(n=5)和流式细胞术检测组(n=5)。②采用免疫组化SP法检测皮质半胱氨酸蛋白酶3表达:应用MetaMorph显微图像分析系统于400倍光镜下随机观察并测量灶周皮质5个不重复视野神经细胞胞浆半胱氨酸蛋白酶3阳性表达光密度值,计算其平均数。③流式细胞术检测细胞凋亡率和灶周皮质半胱氨酸蛋白酶3的表达:经计算机分析系统,绘制细胞数DNA分布图,以二倍体峰前亚二倍体峰(凋亡峰)判定细胞凋亡,计算DNA断裂的凋亡细胞百分数(细胞凋亡率)。④透射电镜取材和观察:开颅取脑后,立即取梗死灶周1mm×1mm×2mm大小的标本,经过一系列处理后,在光镜下进一步确认已切到梗死灶周后,行超薄切片。醋酸铀、枸橼酸铅双重染色后,日立H-9000型透射电镜进行超微结构观察并照相。⑤结果行单因素方差分析。结果:66只大白兔全部进入结果分析。①免疫组化及流式细胞术分析发现,半胱氨酸蛋白酶3在2h缺血再灌注1h迅速增多,并随再灌注时间延长而加剧,3d达高峰,然后逐渐下降,14d仍高于基线水平。②灶周皮质凋亡率和脱氧核苷酰转移酶法计数TUNEL阳性细胞数在再灌注1h也逐渐增多,1～3d达高峰,然后逐渐下降,14d降至基线水平。③超微结构显示假手术组的细胞结构正常。再灌注3d神经元损伤最重,7d时形态有所改善。结论:半胱氨酸蛋白酶3活性表达在再灌注期先于凋亡发生前,并且其表达时程较长,是检测缺血再灌注凋亡的敏感指标,也是溶栓后治疗的靶点。

Spatiotemporal expression of caspase-3 in perifocal cortex after focal cerebral ischemia and reperfusion