重组siRARγ腺病毒构建及其对小鼠肝脏祖细胞分化的影响 |
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作者姓名: | 周建武 何昀 龚梦嘉 毕杨 |
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作者单位: | 周建武 (重庆医科大学 附属儿童医院 儿研所干细胞实验室儿童发育疾病研究教育部重点实验室 重庆市干细胞治疗工程技术研究中心,重庆,400014); 何昀 (重庆医科大学 附属儿童医院 儿研所干细胞实验室儿童发育疾病研究教育部重点实验室 重庆市干细胞治疗工程技术研究中心,重庆,400014); 龚梦嘉 (重庆医科大学 附属儿童医院 儿研所干细胞实验室儿童发育疾病研究教育部重点实验室 重庆市干细胞治疗工程技术研究中心,重庆,400014); 毕杨 (重庆医科大学 附属儿童医院 儿研所干细胞实验室儿童发育疾病研究教育部重点实验室 重庆市干细胞治疗工程技术研究中心,重庆,400014); |
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基金项目: | 国家自然科学基金(项目编号:81100309) |
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摘 要: | 目的构建并筛选小鼠RARγ基因的siRNA腺病毒载体,并探讨抑制RARγ表达对小鼠肝脏祖细胞分化的影响。方法设计3对特异性针对小鼠RARγ基因的siRNA序列,体外退火形成双链,与SfiⅠ酶切后的pSES-HUS质粒连接,随后在BJ5183中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组获得pAd-siRARγ重组腺病毒质粒,并在HEK293细胞中包装腺病毒Ad-siRARγ。腺病毒感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d,real-time PCR及Western blot检测RARγ的表达,1μmol/L ATRA诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色检测肝脏细胞分化的状态。结果 PCR、酶切鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,测序结果与设计的siRNA序列一致。腺病毒在HEK293细胞中包装10 d可见红色荧光细胞的云雾状扩增,HP14.5d细胞的48 h腺病毒感染率为60%。其中,Ad-siRARγ2、3可有效抑制小鼠HP14.5d细胞中RARγ的表达(P0.05)。ATRA可诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色阳性细胞明显高于对照组,Ad-siRARγ2,3可显著抑制ATRA诱导的小鼠HP14.5d细胞的ALB表达和糖原合成能力(P0.05)。结论成功构建并筛选出能有效抑制RARγ表达的siRNA腺病毒,感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d能显著抑制ATRA诱导的肝细胞成熟分化。
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关 键 词: | 维甲酸核受体γ 腺病毒载体 小干扰RNA 肝细胞分化 |
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