EPHX2基因过表达质粒的构建及意义探讨 |
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作者姓名: | 费敏 李平 赵婷婷 孙斯凡 古艳婷 王华 张浩军 杨靖 |
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作者单位: | [1]北京中医药大学,北京100029 [2] 中日友好医院临床研究所,北京100029 |
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基金项目: | 本课题为国家自然基金资助项目(No.81173422);国际科技合作专项项目(No.2011DFA31860) |
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摘 要: | 目的:构建LETO、OLETF大鼠EPHX2基因过表达重组质粒,观察其在人胚肾细胞(human embryonic kidney 293T,HEK293T)中的表达,及对HEK293T细胞NF-κBp65 mRNA表达的影响.方法:提取LETO、OLETF大鼠肾脏组织总RNA,RT-PCR方法扩增编码EPHX2基因的cDNA,克隆至T-载体并测序,经亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,构建两型大鼠EPHX2过表达重组质粒,酶切鉴定并测序,采用磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞系.Western Blot方法检测EPHX2融合蛋白的表达,RT-PCR方法检测EPHX2基因过表达对HEK293T细胞NF-κBp65表达水平的影响.结果:(1)两个重组质粒均含有完整EPHX2 cDNA,测序证实OLETF型大鼠较LETO型大鼠EPHX2重组质粒有五个核苷酸位点的改变.(2)转染HEK293T细胞后,Western Blot证实融合蛋白成功表达;(3)TNF-α刺激增加HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达;(4)EPHX2基因过表达促进TNF-α刺激后的HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达升高(P〈0.05).结论:成功构建LETO型及OLETF型大鼠EPHX2过表达重组质粒(L-EPHX2/V5、O-EPHX2/V5),可在HEK293T细胞中过表达.为进一步探讨EPHX2基因在糖尿病肾病发生发展中的作用奠定了基础.
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关 键 词: | EPHX2 重组质粒 NF-κBp65 糖尿病肾病 |
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