| EPHX2基因过表达质粒的构建及意义探讨 |
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| 引用本文： | 费敏,李平,赵婷婷,孙斯凡,古艳婷,王华,张浩军,杨靖.EPHX2基因过表达质粒的构建及意义探讨[J].中国中西医结合肾病杂志,2014(2):103-106. |
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| 作者姓名： | 费敏 李平 赵婷婷 孙斯凡 古艳婷 王华 张浩军 杨靖 |
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| 作者单位： | [1]北京中医药大学,北京100029 [2] 中日友好医院临床研究所,北京100029 |
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| 基金项目： | 本课题为国家自然基金资助项目（No.81173422）;国际科技合作专项项目（No.2011DFA31860） |
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| 摘 要： | 目的：构建LETO、OLETF大鼠EPHX2基因过表达重组质粒,观察其在人胚肾细胞（human embryonic kidney 293T,HEK293T）中的表达,及对HEK293T细胞NF-κBp65 mRNA表达的影响.方法：提取LETO、OLETF大鼠肾脏组织总RNA,RT-PCR方法扩增编码EPHX2基因的cDNA,克隆至T-载体并测序,经亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,构建两型大鼠EPHX2过表达重组质粒,酶切鉴定并测序,采用磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞系.Western Blot方法检测EPHX2融合蛋白的表达,RT-PCR方法检测EPHX2基因过表达对HEK293T细胞NF-κBp65表达水平的影响.结果：（1）两个重组质粒均含有完整EPHX2 cDNA,测序证实OLETF型大鼠较LETO型大鼠EPHX2重组质粒有五个核苷酸位点的改变.（2）转染HEK293T细胞后,Western Blot证实融合蛋白成功表达;（3）TNF-α刺激增加HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达;（4）EPHX2基因过表达促进TNF-α刺激后的HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达升高（P〈0.05）.结论：成功构建LETO型及OLETF型大鼠EPHX2过表达重组质粒（L-EPHX2/V5、O-EPHX2/V5）,可在HEK293T细胞中过表达.为进一步探讨EPHX2基因在糖尿病肾病发生发展中的作用奠定了基础.
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| 关 键 词： | EPHX2 重组质粒 NF-κBp65 糖尿病肾病 |
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