差速贴壁技术对大鼠脑皮质星形胶质细胞纯化率的影响

目的:观察差速贴壁技术对星形胶质细胞纯化率的影响,旨在建立一套可靠的大鼠脑皮质星形胶质细胞的取材分离、纯化培养技术。方法:实验于2006-06/08在泰山医学院生命科学研究所完成。实验材料:出生2～3d的Wistar大鼠,雌雄不拘,由泰山医学院生命科学研究所实验动物中心提供。实验方法:选用出生二三天的Wistar大鼠进行脑皮质星形胶质细胞原代培养。实验分两组培养:常规培养组和差速贴壁培养组。差速贴壁培养组分别于15,30min取出,轻轻翻转培养瓶,将上清液移至另一培养瓶中,放入培养箱中继续培养。7～10d后传代,待细胞分层生长后,置于37℃摇床中250r/min振荡18h,倒掉上清液,D-Hank’s液洗3次后,加入0.25%胰酶消化,倒置显微镜下观察,待细胞突起回缩后加入含血清的培养基终止消化,用吸管反复吹打使细胞从瓶壁上脱落,细胞悬液1000r/min离心5min后,弃上清液,加入含体积分数为0.2血清的DMEM培养基混悬沉淀,接种入预先涂有L-多聚赖氨酸的培养瓶中继续培养。采用双重免疫荧光法鉴定星形胶质细胞纯度,测定积分吸光度值判断星形胶质细胞的生长状况。结果:①应用差速贴壁技术培养星形胶质细胞可明显提高星形胶质细胞纯度[常规培养组:(82±3)%,差速贴壁培养组15min:(94±2)%,差速贴壁培养组30min:(95±2)%,P<0.01]。差速贴壁需要充分的时间,15min组和30min组在提高星形胶质细胞纯度方面无明显差别。②差速贴壁培养组星形胶质细胞积分吸光度值高于常规培养组(常规培养组:528±25,差速贴壁培养组15min:972±17,差速贴壁培养组30min:996±35,P<0.05)。结论:①差速贴壁技术可明显提高星形胶质细胞纯化度,并且星形胶质细胞生长状态明显优于常规培养方法。②最佳差速贴壁时间为15min,过长差速贴壁时间对提高星形胶质细胞纯度无明显影响。

Influence of differential velocity adherent technique on the purified rate of cerebral astrocytes in rats