问号赖型钩体017株与七日热型钩体56610株内鞭毛蛋白基因的克隆及序列分析

目的通过不同型钩体DNA序列分析筛选钩体基因疫苗的候选株,并从基因水平解释钩体血清型的特异性.方法(1)酚、氯仿抽提法提取017株与56610株钩体基因组DNA.(2)分别以017株与56610株钩体基因组DNA为模板,PCR法扩增内鞭毛蛋白(flaB)基因.(3)T/A快速克隆法将两个flaB基因的PCR产物连接与Teasy-vector载体.(4)α-互补、PCR法初步筛选重组质粒.(5)碱裂解法小量提取质粒、酚切分析进一步鉴定重组质粒,确定外源基因插入方向.(6)双脱氧终止法对重组质粒的克隆化flaB基因进行测序.(7)应用软件对所测序列进行酶切位分析及编码蛋白的预测.(8)与已发表的钩体内鞭毛基因进行比较.结果经鉴定获得了两个重组质粒pDHTF017与pDHTF610.pDHTF017中flaB基因为反向插入,pDHTF610中的flaB基因为正向插入.两个重组外源flaB基因长度均为852bp,编码蛋白含283个氨基酸,预测分子量为31.5kD左右.两个基因的限制性内切酶位点相似,含多个常见酶切位点.几个血清型钩体的flaB基因比较发现型间同源性很高(90%-99%),变异通常发生在固定位点,各型选择不同的固定位点.结论(1)重组质粒pDHTF017与pDHTF610中的外源基因均为钩体的一种flaB基因;(2)flaB基因保守性强,可作为基因疫苗的靶基因;(3)七日热型钩体56610株的flaB基因有望成为核心抗原基因,可进行钩体疫苗的研究开发.