反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质细胞的作用

目的　构建反义 GFAP逆转录病毒表达载体 ,评价其对培养正常及损伤星形胶质细胞 (Ast)形态及GFAP基因表达的影响。　方法　用定向克隆技术 ,将 1.1kb的 GFAP基因片段反向插入逆转录病毒载体 p L XSN上 ,获得重组体 PL Bsk G,经病毒包装、抗性克隆筛选、滴度测定等 ,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养 ,收获病毒上清液感染体外培养的 Ast,通过免疫组织化学、原位杂交、RT- PCR、Southern blot和流式细胞仪分析等方法 ,研究 PL Bsk G对正常及损伤 Ast的生长、细胞增殖周期、细胞形态结构、GFAP基因表达的影响。　结果　插入PL Bsk G中的 GFAPc DNA片段序列、方向完全正确 ,Southern杂交及 RT- PCR分析表明 ,PL Bsk G成功整合入PA317细胞中 ,并实现了在 NIH3T3细胞中的表达。PL Bsk G使正常及反应性 Ast生长抑制 ,G1期阻滞 ,Ast胞体变圆、胞浆减少、突起变细、回缩 ,核浆比例增大。GFAP免疫组织化学染色减弱 ;GFAP m RNA表达水平降低。　结论　获得了构建正确的反义 GFAP逆转录病毒表达载体 ,并证实其对正常及反应性 Ast形态结构、GFAP表达水平等均有明显的影响 ,为深入研究 Ast反应及 GFAP基因的功能创造了条件。

THE CONSTRUCTION OF ANTISENSE GFAP RETROVIRUS EXPRESSING VECTOR AND THE EFFECT ON ASTROCYTE