构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景：超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel, HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势，成为目前最受关注的生物起搏备选基因。 目的：构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体，并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外实验，于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。 材料：SD大鼠10只，由中山大学实验动物中心提供。携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存。腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司。 方法：质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段，亚克隆至pShuttle-CMV中，得到重组穿梭质粒；I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4，回收CMV-HCN4片段，亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi，得到重组腺病毒质粒；重组腺病毒质粒酶切线性化后，应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增，得到重组腺病毒AdHCN4；应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组腺病毒质粒载体的鉴定，重组腺病毒的鉴定及滴度测定，重组腺病毒的感染效率。 结果：构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切，得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp (pShuttle-CMV)两个片段，DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中；重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用XhoⅠ酶切得到7个片段，而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段；重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用；重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带；经多次重复感染后，病毒滴度检测达2.5×1011PFU/mL。成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白，当病毒感染复数值为800，转染效率最高，达90%。 结论：实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体，并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞。

Construction of recombinant adenovirus containing human HCN4 gene and its transfection efficiency in rat bone marrow mesenchymal stem cells