用于筛选顺式反应元件的慢病毒启动子报告载体随机文库的构建

【摘要】 目的 建立含有随机序列与miniCMV融合的启动子，驱动抗生素耐药基因的表达；用于筛选和寻找不同处理条件下的反应性元件。方法 设计针对Puromycin抗性基因，即嘌呤霉素N 乙酰转移酶基因（puromycin N acetyl transferase gene, PAC）的引物，扩增目的条带并通过PacI+Pme1限制性内切酶克隆至目的载体pWPI；然后，设计并合成接头序列+20N随机序列+ miniCMV的融合片段，通过PCR的方法得到双链序列，并进行酶切，通过Cla1+PacI克隆入前述pWPI PAC载体。克隆得到的载体组合即为慢病毒反应元件筛选报告载体文库。在此基础上，我们将报告载体文库转染细胞，并进行超声照射。超声照射剂量为10min，100mW/cm2。每天一次，一共照射3天。每次超声照射后，对细胞进行puromycin处理。4天后，收集超声照射存活细胞，提取DNA，PCR扩增含有20N的序列并进行测序鉴定。结果 我们成功设计了一套文库构建方案，初步构建了20N随机序列+ miniCMV +Puromycin抗性基因的文库。将该文库转染细胞，超声照射后可以增加转染有对超声反应克隆细胞中抗性基因表达；我们通过获取Puromycin处理后的存活细胞，发现了潜在的对超声反应的调控元件。结论 我们构建的20N随机序列+ miniCMV +Puromycin抗性基因文库，可以用于筛选对超声等特定条件有表达调控反应的顺式反应元件；进而为该元件控制基因表达提供依据。

Construction of lentivirus based promoter reporter random library for screening context dependent cis elements