脂氟显微泡及质粒浓度对基因转染效率影响的研究

目的 研究脂氟显微泡及质粒浓度对pcDNA6.2-GW/EmGFP重组质粒转染效率及人肝癌HepG₂细胞死亡率的影响,初步探索转染最佳条件及shRNA重组质粒对靶基因survivin的抑制效果。方法 将重组质粒加入各组,设置6个质粒浓度梯度组。向各组加入脂氟显微泡混悬液,设置6个微泡浓度梯度组。对照组不加入微泡和质粒。根据前期优化结果,采用治疗性超声(1.2W/cm₂、占空比20%)辐照90s。48h后使用荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞GFP表达效率。细胞死亡率通过台盼蓝染色计数获得。设立阳性质粒组P(+)和阴性质粒组P(－),western blot检测靶基因蛋白表达水平。 结果 当脂氟显微泡浓度小于等于 150μl/ml 时,转染率随微泡浓度增加而增加；当大于 150μl/ml 时,转染率却随微泡浓度增加而降低(p<0.05)。HepG₂细胞死亡率随微泡浓度增高,呈上升趋势(p<0.05)。在一定范围(20μl/ml)内,增加质粒浓度可以提高转染效率(p<0.05)；但继续增加质粒浓度对基因转染率无明显影响(p>0.05)。质粒浓度的改变对细胞死亡率无明显影响。Western blot结果表明, P(+)组survivin基因表达受到明显抑制。结论 超声联合微泡可以有效介导基因转染,当微泡浓度为 150μl/ml,质粒浓度为 20μl/ml时,基因转染率最高,细胞死亡率较低。阳性重组质粒P(+)可下调靶基因表达水平,为后续基因转染的相关研究奠定基础。

Optimization of microbubble and plasmid concentration for gene transfection