电穿孔介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性

目的:电穿孔的原理是应用短暂高压电脉冲使细胞膜形成纳米级的微孔,外源DNA通过这些微孔或者伴随微孔关闭时膜成分的再分布而直接进入细胞内.实验拟验证电穿孔法介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性和转染效率,以获得基因治疗自体移植的载体.方法:实验于2006-10/2007-09在暨南大学医学院中心实验室完成.①材料:清洁级1～3 d龄SD大鼠3只,购于广东省医学实验动物中心,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.基因转染过程应用的pEGFP-N1质粒由本课题组保存.②实验方法:大鼠颈椎脱臼处死,在无菌条件下分离四肢肌组织,剪碎成1 mm×1 mm×1 mm组织块,采用改良酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,再以差速贴壁和非连续梯度离心法分两步进行纯化,细胞均匀增殖至培养面80%或局部增殖过度密集时胰酶消化传代.取第3代处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞,消化离心后调整细胞数为2.0×107L-1,取400 μL注入4 mm电击杯中,再加入pEGFP-N1质粒15 μg混匀,将电击杯放入电转槽静置5 mim.电击条件为电容1050 μF,电压180 V,脉冲时间20 ms,脉冲数2次,脉冲间隔时间1 min,电击缓冲液为不含钙镁的磷酸盐缓冲液.放电后电击杯冰浴,并用不含血清的DMEM清洗,将清洗液转入培养瓶中,4h后换用体积分数为0.1胎牛血清的完全培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2无菌细胞培养箱中培养.同时设不加质粒的空白对照.③实验评估:倒置显微镜下观察细胞生长状况.免疫细胞化学检测肌动蛋白的表达.随机计数多个低倍视野,计算电穿孔pEGFP-N1质粒转染卫星细胞的效率.绘制细胞生长曲线,并用流式细胞仪测量细胞周期.结果:①骨骼肌卫星细胞的形态:原代培养48～72 h细胞完全贴壁,呈梭形或纺垂形,长轴平行排列,胞核圆形,核仁明显.5 d时细胞町伸出一个或数个突起.随培养时间的延长,卫星细胞连接成网状.当延迟分瓶或使用分化培养基,相邻的细胞会融合成肌管,继而形成串联,且能看见肌管的跳动.传代后细胞形态旱更加一致的梭形,6 h即完全贴壁,细胞增殖速度明显加快,生长更为旺盛.传至8代卫星细胞出现老化现象.②免疫细胞化学检测:骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达.③转染效率:pEGFP-N1质粒电转染8 h后即可看见散存发绿色荧光的卫星细胞,48～72 h达高峰,阳性表达率约35%.④细胞生长曲线及细胞周期检测:电转染细胞接种后第3天进入对数生长期,第7天由于接触抑制导致增殖速度减慢,81.5%处于G0/G1期,19.3%处于S G2 M期.未转染细胞生长曲线、细胞周期均与其相似.结论:电穿孔法介导外源性基因表达于大鼠骨骼肌卫星细胞具有较高的转染效率,操作简便,重复性好,且对卫星细胞生物学行为无明显影响.

Feasibility of transfecting exogenous genes into rat skeletal myoblasts by electroporation