α烯醇化酶靶向RNA干扰对原代培养乳鼠心肌细胞能量代谢及收缩功能的影响

目的采用RNA干扰技术抑制培养大鼠心肌细胞α烯醇化酶的表达，探讨α烯醇化酶对心肌细胞能量产生和收缩功能的影响。方法针对α烯醇化酶基因，化学合成3对小片段干扰RNA（siRNA）（分别为针对α烯醇化酶mRNA406-425位点的序列1，针对α烯醇化酶mRNA656～675位点的序列2及针对α烯醇化酶mRNA754～773位点的序列3）并转染原代培养的WKY大鼠心肌细胞。采用Real—time RT-PCR和Western blot技术分别在mRNA和蛋白水平检测α烯醇化酶的表达情况，筛选其中沉默效应最好的序列（序列1）转染心肌细胞，即RNA干扰实验组，以未转染siRNA的心肌细胞为对照组，荧光素荧光素酶法检测细胞ATP水平，视频跟踪计算机测定系统测定细胞收缩反应，参数包括最大收缩幅度（dL），最大收缩速度（dL／dtmax）。结果针对α烯醇化酶mRNA 406-425位点的siRNA显著下调α烯醇化酶mRNA和蛋白的表达，并且呈剂量和时间依赖关系，200nmol／L可达到最大沉默效应，其下调α烯醇化酶mRNA和蛋白表达的最大效应分别出现在转染后24h和48h。α烯醇化酶沉默后细胞ATP产生减少（3．55×10^-7nmol／mg蛋白），dL（0．82±0．02）μm]和dL／dtmax（2．7±0．3）μm／s]下降。结论应用siRNA技术靶向α烯醇化酶mRNA406～425位点可有效下调心肌细胞a烯醇化酶的表达，使细胞产能减少，收缩功能下降。