以慢病毒为载体的整合素β8 RNAi在新生鼠脑内干扰效率的研究

目的 制备稳定表达pSicoR-β8 shRNA的慢病毒载体系统，并评估其在新生鼠脑内RNA干扰（RNAi）效率。方法 将慢病毒表达载体pSicoR-β8 shRNA、pSicoR-对照序列与慢病毒包装质粒系统pDM2G、g/p RRE和pRSV Rev分别进行扩增及质粒酶切鉴定，然后共转染293T包装细胞株，通过293T细胞的包装和分泌以收集携带目的干扰片段的慢病毒颗粒。利用PEG-it病毒浓缩试剂进行浓缩，50%组织培养感染剂量法（TCID50）测定病毒滴度。将浓缩后的慢病毒颗粒通过侧脑室注射对新生SD乳鼠中枢神经系统野生表达的整合素β8进行干扰，荧光显微镜下观察慢病毒侧脑室注射后脑组织中绿色荧光蛋白（GFP）的表达，结合RT-PCR和Western blot方法检测β8 mRNA和蛋白在干预后表达水平的变化，以评估RNAi效率及选择最佳干预时间。结果 质粒扩增及酶切结果显示各质粒片段大小分别与质粒图谱大小一致，浓缩后测得的病毒滴度为LV-对照序列:1.0×108PFU/mL，LV-β8 shRNA:5.0×108PFU/mL。慢病毒侧脑室注射后1 d，侧脑室周围即可观察到携带GFP的慢病毒整合到宿主细胞基因组并发出绿色荧光，注射后2 d、3 d和5 d可在脑组织切片中观察到较强的绿色荧光。β8 mRNA表达水平在RNAi后1~3 d出现降低（P＜0.05），第3天达到最大抑制作用，其β8 mRNA抑制率约为56％。β8蛋白表达变化趋势与β8 mRNA表达变化趋势基本一致，RNAi后第3天达到最大抑制作用，其β8蛋白抑制率约为51％。结论 成功获得滴度达到体内实验要求的含有β8 shRNA的慢病毒颗粒，并具有较好的体内干扰活性，为进一步研究整合素β8在新生鼠脑组织中的生理功能奠定了基础。