WT1基因异构体比例转变对白血病细胞株NB4增殖的影响

背景与目的:WT1基因编码一个锌指转录因子,在白血病细胞中高表达并与预后呈负相关。WT1基因mRNA通过2个可变性的剪切位点产生4种不同的拼接异构体,4种异构体在表达WT1的不同组织中各以其相对稳定的比例表达,白血病细胞中WT1不同异构体表达的意义尚不清楚。本研究拟用WT1基因异构体WTA转导急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4,以探讨WT1基因异构体对NB4细胞增殖的影响及其分子机制。方法:用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6 转导NB4细胞,建立WT1基因异构体表达比例改变的细胞株并用有限稀释法进行单克隆化。采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成实验及细胞周期动力学检测,了解WT1基因异构体表达比例改变对NB4细胞生长的影响。用半定量RT-PCR检测NB4细胞中p53、p21、CyclinE、CyclinD1、CyclinA1基因表达的改变。结果:WT1基因异构体能够通过电穿孔方法成功转染NB4细胞,外源基因在NB4细胞中稳定整合及表达,并通过有限稀释法将永久表达细胞株单克隆化。用台盼蓝拒染法绘制细胞生长曲线,提示转染WT1基因异构体的细胞NB4/WTA生长明显慢于对照组NB4/CMV细胞及未转染的NB4细胞,NB4/WTA细胞生长曲线平缓,在第3天达平台期(78.7±18.0)×104/ml,对照组NB4/CMV细胞及NB4细胞在第4天出现生长平台期达(146.0±21.0)×104/ml。MTT法检测细胞增殖活性,结果显示,NB4/WTA细胞在各个时间段的抑制率均高于对照组,P<0.005。甲基纤维素集落形成试验中NB4/WTA克隆形成率明显下降,集落形成抑制率为46.9%。在As2O3(终浓度0.2μmol·L-1)作用后集落形成抑制更加明显。细胞周期动力学检测提示,NB4/WTA组S期细胞比例升高。RT-PCR检查提示,NB4/WTA细胞p21、CyclinA1基因的表达较对照组升高。结论:增加外源性WT1基因异构体WTA的表达将WT1基因异构体表达的比例由 17AA/ KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能抑制NB4细胞的增殖,使其克隆形成能力明显下降。这可能与p21、CyclinA1基因表达上调,细胞周期阻滞于S期有关。

Inhibitory effect of WT1 gene isoform transfection on proliferation of leukemia cell line NB4