防己诺林碱阻断自噬抑制 H1N1病毒感染的研究

目的 探索防己诺林碱在细胞水平抗H1N1病毒的作用，阐明防己诺林碱调控细胞自噬抑制H1N1病毒复制的分子机制。方法 CCK-8法检测0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0、40.000 0、60.000 0 μmol·L^-1的防己诺林碱对MDCK细胞活力的影响；MDCK细胞设置对照组、模型组和防己诺林碱（2.5、5.0、10.0 μmol·L^-1）组，除对照组外，以感染复数（MOI）为0.1的H1N1病毒感染MDCK细胞，加入防己诺林碱共同孵育12 h，同时设置防己诺林碱（10.0 μmol·L^-1）与病毒共同孵育4、8 h组，通过实时荧光定量PCR （qRT-PCR，检测HIN1 mRNA表达）和Western blotting ［H1N1病毒核蛋白（NP）］检测防己诺林碱对病毒复制的抑制作用；PI/Hoechst 33342染色检测防己诺林碱（10.0 μmol·L^-1）对MDCK细胞死亡的影响；qRT-PCR法检测防己诺林碱检测防己诺林碱预处理、病毒感染早期药物处理、病毒感染晚期药物处理以及吸附和进入阶段给药对病毒复制的影响；MDCK细胞转染EGFP-LC3或EGFP-mCherry-LC3双荧光质粒，观察防己诺林碱对EGFP-LC3的荧光强度、EGFP-mCherry-LC3共定位的影响，设置自噬诱导剂雷帕霉素（0.5 μmol·L^-1）、自噬晚期抑制剂氯喹（10 μmol·L^-1）、巴佛洛霉素A1 （100 nmol·L^-1）对照。转染过EGFP-LC3质粒的MDCK细胞感染H1N1病毒，免疫荧光检测防己诺林碱对LC3与胞内的病毒NP蛋白共定位的影响；体外培养A549细胞，以MOI为0.1的H1N1病毒感染，Western blotting检测防己诺林碱对LC3II/LC3I蛋白表达的影响。结果 防己诺林碱对MDCK细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为40.19 μmol·L^-1 ；与模型组比较，防己诺林碱以浓度相关性的方式抑制HIN1 mRNA表达，以浓度和时间相关性的方式抑制NP蛋白表达（P＜0.01、0.001）；显著减少H1N1诱导的细胞死亡（P＜0.001）；抑制H1N1病毒进入过程。与对照组比较，防己诺林碱处理诱导LC3荧光聚集，诱导EGFP-LC3和mCherry-LC3双荧光共定位显著增加（P＜0.001）。与模型组比较，防己诺林碱处理明显减少NP的荧光数量（P＜0.001），同时造成LC3荧光积累并与胞内的病毒NP蛋白共定位；引起LC3II积累（P＜0.01、0.001）。结论 防己诺林碱同氯喹和巴佛洛霉素A1一致，阻断自噬途径，使病毒粒子在自噬体内滞留，破坏病毒生命周期。

Effect of fangchinoline against H1N1 infection by blocking autophagy