miR-200c改善转化生长因子－β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化的机制

目的探讨miR-200c是否通过调节自噬缓解转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤维化。方法不同浓度(0、5、10、15、20、30 ng/ml)TGF-β1刺激HK2细胞48 h后倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8检测细胞增殖情况。选择致HK2细胞增殖最快的TGF-β1浓度(c)进行转染实验:细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA(NC组);细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(NC+T组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics(M组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(M+T组)。qRT-PCR检测miR-200c转染效率。Western blotting检测4组细胞Smad通路蛋白Smad2和Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙黏蛋白(E-cad)表达量,以及自噬相关蛋白LC3(包括LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值)和P62。结果 10 ng/ml的TGF-β1刺激HK2细胞48 h后增殖最快,镜下细胞形态由正常的卵圆形铺路石状变为长梭形,纤维化形态最明显。qRT-PCR显示M组miR-200c表达量是NC组(212.42±12.25)倍(t=24.41,P=0.000),说明转染有效。Western blotting结果显示,与NC组比较,NC+T组加入10 ng/ml TGF-β1的HK2细胞Smad2、Smad3和α-SMA表达量增加,E-cad蛋白表达量降低(P0.05)。与NC+T组比较,M+T组Smad2、Smad3和α-SMA表达量减少,E-cad表达量增加(P0.05),提示miR-200c表达增加抑制了纤维化。进一步发现,M组较NC组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示自噬活性增加;M+T组较NC+T组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示miR-200c表达升高缓解了纤维化程度。结论 miR-200c可能通过激活细胞自噬缓解TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。