丹参酮ⅡA对雷帕霉素诱导自噬M2巨噬细胞共培养的皮肤黑素瘤A375细胞EMT的影响

 

目的 通过建立肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）自噬水平改变对与之共培养的A375细胞的体系，进一步明确TAMs自噬在调控A375细胞上皮间质转化（EMT）及迁移侵袭过程中的作用。 方法 用PMA和IL-4相继作用于人单核细胞THP-1 72 h诱导其成M2型，流式细胞术及免疫荧光检测鉴定M2表面CD68、CD204、CD206等标志性分子表达情况，鉴定TAMs极化效率。用自噬调节剂雷帕霉素干预TAMs（M2） 24 h，去除自噬调节药物的干预48 h后，通过蛋白免疫印迹方法以及免疫荧光检测各组细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表达，确定药物干预后的TAMs自噬水平。将雷帕霉素干预后的TAMs与人黑素瘤A375细胞进行非接触共培养，48 h后加入不同浓度TanⅡA 1 mg/L（低浓度）组、4 mg/L(高浓度）组，继续培养48 h后，Western blot检测A375细胞EMT相关因子的表达，并通过transwell检测A375细胞的侵袭和迁移能力。 结果 人单核细胞THP-1经PMA和IL-4先后作用共72 h后，细胞状态由半悬浮变为贴壁，经流式细胞术、免疫荧光检测发现M2表面CD68、CD204、CD206的表达较M0组明显增强，差异具有统计学意义(均P<0.05)。用自噬调节剂雷帕霉素干预TAMs 24 h后，免疫荧光、Western blot检测显示，LC3-Ⅱ及Beclin-1的表达明显上调，差异具有统计学意义(均P<0.05)。TAMs和A375细胞非接触共培养48 h后，不同浓度的TanⅡA作用于细胞，Western Blot检测显示，相对于空白组，TanⅡA低浓度组和高浓度组Beclin1、LC3-Ⅱ和E-cadherin蛋白表达均显著升高，N-cadherin蛋白表达均显著降低，组间差异均具有统计学意义（均P<0.05）。transwell实验显示，TanⅡA低浓度组和TanⅡA高浓度组处理后的A375细胞，其迁移、侵袭能力均有所下降，组间差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论 雷帕霉素可以诱导TAMs发生自噬，TanⅡA可以抑制自噬TAMs与之共培养的黑素瘤A375细胞的EMT过程，从而抑制其侵袭和转移。