PCR-HRM方法分析16S rRNA基因进行细菌鉴定的可行性研究

目的建立一种基于16S rRNA基因进行聚合酶链式-高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)分析方法,用于快速鉴定临床常见感染细菌。方法收集中国人民解放军北部战区总医院2017年8月~2018年10月期间临床分离的167株常见细菌,选取16S rRNA三个高度保守区域(V1,V3,V6)基因序列用于引物设计,在含有饱和荧光染料的体系中进行PCR-HRM分析以区分不同细菌种属。将167株实验菌分为葡萄球菌、链球菌、非发酵阴性杆菌以及其它常见临床分离菌四组进行实验,分别进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和PCR-HRM分析并对结果进行对比,不一致的鉴定结果以测序为金标准。同时进行PCR-HRM方法鉴定临床常见病原菌的灵敏度、重复性和盲法验证试验。结果 PCR-HRM方法与MALDI-TOF MS对167株临床常见分离菌鉴定正确率分别为98.2%和97.0%,这两种方法无明显统计学差异(χ^2=1.97,P=0.727>0.05)。PCR-HRM方法可检测2 pg/μl的模板浓度;将6株革兰阴性菌分成一式三份同时进行PCR-HRM重复性试验,同种实验菌的三份熔解曲线图完全聚类;其盲法验证实验准确率100%。结论该方法通过使用3对16S rRNA引物构造多重差异曲线可对临床常见细菌进行分类到属级甚至种级,且灵敏度高、特异度强,可以作为鉴定临床常见感染菌的新选择。

Feasibility Study on Analysis of 16S rRNA Gene for Bacterial Identification by PCR-HRM Method

QIU Hui-ru;WANG Jia-lin;XUE Wen-cheng;YANG Jing;REN Wei(PostgraduateTraining Base of General Hospital of Northern Theater Command of Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121000 China;Department of Clinical Laboratory,,the General Hospital of Northern Theater Command,Shenyang 110016,China;Department ofInfection Control,the General Hospital of Northern Theater Command,Shenyang 110016,China)