α变形菌纲磁螺菌属TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种快速有效检测环境中α变形菌纲磁螺菌属细菌的方法。方法本研究以α变形菌纲磁螺菌属保守且特异的16SrRNA片段为靶序列,化学合成基因序列,制备重组质粒作为磁螺菌属检测的标准品;用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,针对目的片段基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,进行实时荧光定量PCR检测,运用统计学方法评价该方法的特异性、敏感性及重复性。结果本实验成功构建了质粒PUC19-QC,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.10×101~5.10×107拷贝数之间具有较好的线性关系,相关系数R2=0.999。该法最低可检测到5.10×10个DNA拷贝数,灵敏度明显高于普通PCR;重复性试验表明,荧光定量PCR检测结果 Ct值波动范围较小,Ct值的标准差均小于0.23,表明该法重复性好,可靠性高。析因方差分析表明不同稀释度之间的Ct值差异有统计学意义(F=3 125.305,P0.001),三个批次的再现性良好,差异无统计学意义(F=0.057,P=0.945),而浓度分组与时间之间也无交叉效应(F=0.533,P=0.873)。结论本实验所建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术,能够快速有效地检测α变形菌纲磁螺菌属细菌,且检测结果稳定,受外界条件如时间、气温等影响小。