| 摘 要： | 目的建立高效检测刚地弓形虫(Toxoplama gondii)的环介导等温扩增(LAMP)方法,为弓形虫病诊断提供新的技术手段。方法采用在线引物设计软件Primer Explorer 4.0设计弓形虫529 bp基因LAMP扩增引物,用已构建的pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,建立LAMP扩增反应,通过添加环引物、设置不同浓度的甜菜碱和Mg SO_4以及不同反应温度对扩增反应体系和反应条件进行优化。以猪、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、猪等孢球虫(Isospora suis)的基因组DNA和超纯水为对照,pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的特异性。将pMD-19T-529 bp重组质粒梯度稀释为109~100copies/ml,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的灵敏性。结果设计的LAMP扩增引物可扩增出弓形虫529 bp序列保守区域的目的片段。优化结果显示,最佳反应总体系为25μl,其中,甜菜碱最佳浓度为0.4 mol/L,Mg SO_4最佳浓度为6 mmol/L;添加环引物反应30 min的扩增效率与未添加环引物反应60 min的扩增效率相当,可使反应时间缩短30 min;最佳反应条件为63℃30 min,80℃3 min。特异性检测结果显示,所建立的LAMP方法可特异扩增弓形虫529 bp基因片段,对照均未扩增出目的片段。灵敏性检测结果显示,LAMP方法的最低检出值达10~3 copies/ml,效率为PCR扩增(10~4 copies/ml)的10倍。结论建立了弓形虫529 bp重复序列的LAMP检测方法,该法具有较好的特异性和灵敏性。
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