结核分枝杆菌甲硫腺苷核苷酶的原核表达及活性分析

目的 克隆、表达、鉴定结核分枝杆菌(MTB) Rv0091基因编码蛋白,分析酶活性,初步鉴定其功能.方法 构建Rv0091基因原核表达质粒,在大肠杆菌BL21trxB进行表达,经IPTG诱导,Ni2+-NTA柱纯化后获得可溶性蛋白,通过SDS-PAGE分析目的蛋白纯度、Western blot进行免疫学活性鉴定、质谱分析重组蛋白相对分子质量、酶耦联法检测酶活性,分析酶学性质.结果 成功构建Rv0091基因原核表达质粒,建立了可溶性蛋白最佳表达体系,获得纯度在95％以上的可溶性蛋白,Western blot结果证实重组蛋白为结核分枝杆菌蛋白,质谱鉴定其相对分子质量与理论值基本一致,酶学活性实验证实重组蛋白能够分解底物5′-甲硫腺苷(MTA),酶学性质分析表明最适缓冲液为磷酸盐缓冲液和Hepes,酶的热稳定性较差,37℃为最适反应温度,最适pH为10 ～ 12.结论 初步证明该重组蛋白在体外能够分解MTA,发挥甲硫腺苷核苷酶(MTAN)的作用,可能在MTB的代谢中起关键作用.