人胎儿肝脏来源C-kit+细胞的特征*◆

背景：在成年动物肝脏中干细胞含量很少，且体外大量扩增并保持未分化状态的问题仍然没有很好的解决，许多科研者预测胚胎肝干细胞可能具有诱人的临床应用价值。近年来C-kit被选择作为研究肝干细胞的共同标志，并发现C-kit抗原参与肝干细胞的生长和发育。 目的：对胎儿肝脏来源的C-kit+细胞进行分离培养，观察其体外生长和分化的特征。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-10/2008-03在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成。 材料：肝脏C-kit+细胞来源于32例流产胎儿，由南京大学医学院附属鼓楼医院提供。Percoll分离液为Pharmacia公司产品，Ficoll分离液为天津灏阳生物制品科技有限责任公司产品，表皮生长因子、肝细胞生长因子为R&D公司产品。 方法：无菌状态下取出胎儿肝脏，以胶原酶消化法和机械分离法获得胎儿肝脏来源单细胞悬液，分别采用1.070 g/mL Percoll分离液和1.077 g/mL Ficoll分离液进行密度梯度离心，吸取界层细胞，添加含体积分数为0.1 FBS、20 μg/L肝细胞生长因子、40 μg/L表皮生长因子的DMEM/F12新鲜培养基诱导9 d。 主要观察指标：胎儿肝脏中C-kit+细胞计数，界层细胞形态、生长特征、表型及C-kit标志的鉴定，界层细胞诱导分化结果。 结果：未经分离的新鲜胎儿肝脏细胞中C-kit+细胞所占比例仅为1.28%，使用Percoll和Ficoll分离液获取的界层细胞分布在三角形区域内的C-kit+细胞所占比例显著增加，分别为74.21%和72.15%，但绝对数量仍然有限。两种分离液获取的界层细胞在形态、生长状况方面基本相似，免疫细胞化学染色鉴定后大体可分为4类：第1类细胞为C-kit+细胞集落，第2类细胞既呈CD29+、CD90+、CD34-、C-kit-（间充质干细胞表型特征），又较弱地表达细胞角蛋白19（胆管细胞特异性标志），第3类细胞较强地表达细胞角蛋白19，不表达C-kit抗原，第4类细胞高表达CD45，微弱表达CD34、CD90、C-kit。诱导后，界层细胞角蛋白19呈强阳性表达，不表达C-kit、白蛋白、甲胎蛋白及细胞角蛋白18。 结论：胎儿肝脏中的C-kit+细胞数量很少，Percoll和Ficoll分离液均可提高C-kit+细胞的得率。胎儿肝脏中可能存在的一类间充质-胆管细胞的中间态细胞，这种细胞可能有促进C-kit+细胞生长的作用。间充质干细胞可向胆管细胞分化。

Characteristics of C-kit+ cells derived from the human fetal liver