水母雪莲ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

目的优化并建立适合于水母雪莲的ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR引物。方法采用L16(45)正交设计方法,以Taq DNA聚合酶浓度、d NTP浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度5种因素4个水平对水母雪莲ISSRPCR反应体系进行优化;并对反应体系进行验证。采用优化后的反应体系筛选出条带清晰且稳定的ISSR引物,通过退火温度梯度试验确定最佳退火温度。结果最终确立了水母雪莲20μl ISSR-PCR最佳反应体系,即包含Taq DNA聚合酶0.7U、d NTP 0.125mmol/L、引物0.3μmol/L、模板DNA 40ng、Mg~(2+)1.5mmol/L。在此基础上,从84条ISSR引物中筛选出条带清晰且稳定的8条引物,并通过梯度PCR反应确定最佳退火温度。结论经过11份水母雪莲种质验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于后续水母雪莲遗传多样性分析和种质资源鉴定。