| 摘 要： | 目的:利用合成的podocin多肽制备针对斑马鱼podocin的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用于斑马鱼足细胞损伤研究中。方法:(1)设计、合成斑马鱼podocin抗原多肽,将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备抗血清,protein A亲和纯化得到抗podocin多克隆抗体;(2)ELISA和免疫组化检测抗体效价及组织特异性;(3)构建足细胞特异性表达硝基还原酶(NTR)的转基因斑马鱼Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-m Cherry),NTR/MTZ(甲硝唑)系统特异性地诱导足细胞损伤;用podocin反义寡核苷酸阻断正常斑马鱼胚胎podocin mRNA的翻译过程,利用抗podocin抗体对上述两种疾病模型进行免疫荧光染色以验证合成的podocin抗体能否应用于斑马鱼足细胞研究中。结果:(1)化学合成的多肽纯度为92.6%,达到免疫用抗原标准;(2)ELISA和免疫组化染色结果表明抗体效价分别达1∶5.12×105和1∶106;(3)免疫荧光染色表明无论在斑马鱼前肾还是中肾,podocin均特异性地表达于足细胞,且沿着毛细血管袢呈连续、线性分布,表明抗体具有良好的组织特异性;(4)MTZ诱导足细胞损伤24h后见podocin呈粗糙的颗粒状分布,48h后阳性表达面积占整个肾小球面积比值明显下降;(5)显微注射podocin反义寡核苷酸的斑马鱼胚胎出现心包水肿、体轴弯曲的表型,第3天时几乎无Podocin表达,随后逐渐恢复至正常,第5天时表达与正常组无异。结论:所制备的斑马鱼抗podocin抗体效价高、组织特异性强,能够反应足细胞损伤情况,是斑马鱼足细胞研究的有力工具。
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