竞争抑制0610009E02Rik长链非编码RNA重组腺病毒穿梭载体的构建与鉴定

目的 构建可竞争抑制肝细胞内0610009E02Rik长链非编码RNA(lncRNA)的重组腺病毒穿梭载体,为探索0610009E02Rik/Notch1在肝静脉闭塞病(HVOD)肝细胞损伤修复中的作用提供有效实验方法.方法 采用基因组DNA提取试剂盒对截取的C57BL/6小鼠尾进行基因组DNA的提取,通过PCR扩增出0610009E02Rik与Notch1基因第34个外显子重叠的1 000 bp基因序列,并连接入经BamHⅠ/Nhe Ⅰ双酶切后的腺病毒穿梭载体GV359;竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体与辅助包装质粒pBHG共转染HEK293细胞,并对竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒进行包装、扩增,采用氯化铯(CsCl)不连续密度梯度离心与连续密度梯度离心2个步骤对重组腺病毒进行浓缩纯化,并对重组腺病毒滴度进行测定;测定不同感染复数(MOI)竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒感染肝细胞株H2.35的感染效率,并采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)与Western blotting对竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒感染肝细胞株H2.35与同步培养的对照肝细胞中竞争抑制0610009E02Rik lncRNA片段、Notch1 mRNA及0610009E02Rik lncRNA相对表达水平及其蛋白表达水平,并进行统计学分析.结果 ①经基因序列比对分析发现0610009E02Rik与Notch1的第34个外显子存在分子量为1 000 bp的重叠序列,依据0610009E02Rik与Notch1基因序列设计含BamH Ⅰ/Nhe Ⅰ酶切位点特异性引物,通过PCR扩增出片段长度为1 000 bp的0610009E02Rik与Notch1基因第34个外显子重叠序列的竞争抑制0610009E02Rik lncRNA片段,DNA测序结果显示竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体与理论预期序列构建成功.②将竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体转染HEK293细胞后第12天,约90％细胞出现细胞病变(CPE),收集细胞获取病毒液.浓缩纯化病毒液经梯度稀释在感染HEK293细胞后第10天,于显微镜下观察稀释梯度1∶ (10～1010)均出现CPE,病毒滴度约为5.01×109 PFU/mL.③当竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒MOI为80,感染肝细胞株H2.35 48 h后感染效率高达95％.收集经竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒感染后肝细胞,通过RT-PCR检测竞争抑制0610009E02Rik lncRNA片段相对表达水平为同步培养肝细胞株H2.35对照的3.13±0.83倍,且差异有统计学意义(P=0.047);Notch1 mRNA相对表达水平为对照细胞的(0.38±0.08)倍,且差异亦有统计学意义(P=0.010);0610009E02Rik lncRNA相对表达水平为对照细胞的(1.04±0.26)倍,但差异无统计学意义(P＞0.05).经Western blotting检测发现,重组腺病毒感染后肝细胞Notch1蛋白表达水平较对照肝细胞减低,与Notch1 mRNA相对表达水平检测结果相一致.结论 成功构建竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体,重组腺病毒感染肝细胞H2.35后,可下调肝细胞内Notch1 mRNA表达水平及其蛋白表达水平,这为HVOD肝细胞损伤修复的深层机制研究奠定实验数据基础.

Construction and identification of competitive 0610009E02Rik long noncoding RNA recombinant adenovirus shuttle vector