脑源性神经营养因子对胎鼠神经干细胞向神经元方向分化的诱导

背景：神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞，培养干细胞的最终目的是获得相应表型的神经元，从而促进中枢神经系统损伤的修复。但以往相关文献显示神经干细胞分化为神经元的比例不到30%。目的：以脑源性神经营养因子作为诱导分化剂，观察其对胎鼠源性神经干细胞向神经元方向分化的作用。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006-06/2007-08在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。材料：清洁级孕14~17 d的SD大鼠10只，诱导分化剂脑源性神经营养因子为Peprotech产品，胎牛血清为杭州四季青产品。方法：孕鼠处死后取出胚胎，剪碎后机械法体外分离培养神经干细胞，锥虫蓝染色计数，调整细胞密度为2×106，添加B27及碱性成纤维细胞生长因子，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2恒温箱中原代培养，待细胞克隆球明显增大、中央变暗时传代扩增。将培养所得的干细胞克隆球分为2组，诱导组添加体积分数为0.01的胎牛血清+20 μg/L脑源性神经营养因子共培养，血清对照组仅添加体积分数为0.01的胎牛血清。主要观察指标：在倒置显微镜下观察细胞生长、贴壁和分化情况。诱导分化5 d后，行神经元免疫组化鉴定，流式细胞仪检测神经元阳性细胞率。取原代培养未分化的神经干细胞及诱导分化3 d的两组细胞，RT-PCR检测内源性bHLH基因MASH-1的表达。结果：原代培养可获得数十至数百个神经干细胞聚集在一起的神经克隆球，形态规则，立体感强；悬浮生长的克隆球经诱导分化后，逐渐失去其球状的立体外观，邻近克隆球发出的突起可相互连接，3 d后即有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞从克隆周围出现。培养的神经干细胞呈巢蛋白阳性表达，诱导分化后呈微管相关蛋白2阳性表达。与血清对照组比较，诱导组神经元阳性细胞率显著升高（χ2=16.0，P < 0.05）。与未分化的神经干细胞比较，诱导组、血清对照组细胞MASH-1的表达均明显升高，且前者升高幅度明显强于后者（F=21.7，P < 0.05）。结论：脑源性神经营养因子能促进神经干细胞向神经元方向分化，可能与内源性bHLH基因MASH-1的表达升高有关。

Differentiation of fetal rat neural stem cells into neurons induced by brain-derived neurotrophic factor