小鼠Oct4基因克隆及其真核表达载体的构建

背景：Oct4是第一个被发现只在多能细胞中表达的转录因子，其功能被认为是控制细胞多能性的决定性因素。Oct4的这种作用机制目前并未明确。目的：克隆小鼠Oct4基因，构建其真核表达载体pEGFP—N2-Oct4。设计、时间及地点：单一样本研究，于2007—06／09在江西省分子医学重点实验室完成。材料：TRIzol Reagent由Molecular Rearch CenterInc提供；真核表达质粒载体pEGFP—N2由南昌大学第二附属医院分子医学重点实验室提供。方法：用TRlzol Reagent提取小鼠胚胎干细胞总RNA，并经反转录．聚合酶链反应获得小鼠Oct4DNA，将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP—N2上，以构建重组质粒pEGFP—N2-Oct4。主要观察指标：总RNA鉴定结果，RT．PCR扩增产物小鼠Oct4分子质量的鉴定结果，重组表达载体的酶切鉴定结果，克隆质粒的测序结果。结果：获取小鼠胚胎干细胞Oct4基因的全序列cDNA。构建Oct4cDNA真核表达质粒时。将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因，并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论：构建重组质粒pEGFP—N2-Oct4成功，将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因的3’端，即保留了Oct4的生物学活性，又便于在研究Oct4生物学功能实验中可检测到蛋白表达。

Mouse Oct4 gene cloning and its eukaryotic expression vector construction