| 小鼠脂联素重组腺相关病毒载体的构建 |
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| 引用本文： | 张淼,李芳萍,陈黎红,傅静奕,严励,傅祖植. 小鼠脂联素重组腺相关病毒载体的构建[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2006, 10(20): 74-76 |
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| 作者姓名： | 张淼 李芳萍 陈黎红 傅静奕 严励 傅祖植 |
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| 作者单位： | 1. 贵阳医学院附属医院内分泌科,贵州省,贵阳市,550000
2. 中山大学附属第二医院内分泌科,广东省,广州市,510120 |
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| 摘 要： | 目的:构建脂联素重组腺相关病毒载体,为进一步研究脂联素的功能提供基础。方法:实验于2003年在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心进行。以带有小鼠脂联素基因的质粒pcDNA3.0-Ad为模板,聚合酶链反应克隆脂联素基因,并将聚合酶链反应扩增产物定向克隆于pAAV-MCS载体,重组AAV-MCS-Ad质粒经双酶切和测序鉴定。随后采用磷酸钙转染法将pAAV-MCS-Ad、pAAV-RC,pAAV-Helper质粒共转染AAV-293细胞,包装得到重组腺相关病毒穴rAAV-Ad雪。回收病毒原液,采用PEG8000和氯仿纯化浓缩病毒。SDS-PAGE及透射电镜鉴定纯化的病毒,并采用Southernblot测定重组腺相关病毒的滴度。Westernblotting检测rAAV-Ad转染H4IIE细胞后脂联素蛋白的表达。结果:①重组质粒AAV-MCS-Ad经双酶切和测序鉴定证实将脂联素基因已正确插入。②SDS-PAGE和电镜均证实rAAV-Ad病毒已构建成功。③Southernblotting测定病毒滴度约为约2.5×1014L-1,通过rAAV-LacZ转染细胞后X-gal染色计数,病毒的感染滴度在(0.83～1.2)×1010转导单位/mL。④Westernblotting证实rAAV-Ad转染H4IIE细胞后在30ku处见特异的阳性蛋白条带,证明能有效表达脂联素蛋白。结论:成功构建了携带小鼠脂联素基因的rAAV-Ad载体,经纯化浓缩后具有较好的纯度和较高滴度,能有效转染H4IIE细胞,并表达脂联素蛋白,具有良好的功能,为进一步研究其在真核细胞中的功能奠定了基础。
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| 关 键 词： | 遗传载体 腺病毒科/*遗传学 逆转录聚合酶链反应 |
| 文章编号： | 1671-5926(2006)20-0074-03 |
| 修稿时间： | 2006-01-26 |
Construction of recombinant adiponectin adeno-associated virus vectors |
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| Zhang Miao,Li Fang-ping,Chen Li-hong,Fu Jing-yi,Yan Li,Fu Zu-zhi. Construction of recombinant adiponectin adeno-associated virus vectors[J]. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, 2006, 10(20): 74-76 |
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| Authors: | Zhang Miao Li Fang-ping Chen Li-hong Fu Jing-yi Yan Li Fu Zu-zhi |
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