慢病毒介导的犬WRD细胞p53基因沉默及稳定感染细胞系的建立 |
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引用本文: | 李芳,闫琰,张茜,李建宁,姚青,高玉婧,杨怡,孙玉宁.慢病毒介导的犬WRD细胞p53基因沉默及稳定感染细胞系的建立[J].南方医科大学学报,2014(12):1721-1727. |
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作者姓名: | 李芳 闫琰 张茜 李建宁 姚青 高玉婧 杨怡 孙玉宁 |
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作者单位: | 宁夏医科大学总院呼吸与危重医学科;宁夏医科大学生物化学与分子生物学系,宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室 |
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摘 要: | 目的 构建靶向犬p53基因慢病毒干扰载体,建立稳定沉默p53基因的WRD/p53-细胞系。方法 设计并构建4条针对犬p53基因的特异性shRNA干扰质粒。将构建的慢病毒表达载体(p GMLV-p53)和包装质粒(packaging mix)组成的包装系统共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。包装好的慢病毒感染WRD细胞,Western blot和实时荧光定量PCR方法检测不同靶点RNA干扰载体对p53基因的干扰效果,确定有效靶点。针对有效靶点慢病毒颗粒以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染WRD细胞,puromycin抗生素筛选稳定感染细胞系WRD/p53-。结果 结果显示p53 RNAi慢病毒载体构建成功,成功包装四种不同靶点的p53基因RNA干扰慢病毒,病毒滴度均达到1×109TU/ml。四种干扰载体慢病毒均具有较好的干扰效果,选用沉默效果最好的p GMLV-p53A1为最优靶点,成功建立p53 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系WRD/p53-。结论 成功构建p53 RNAi慢病毒载体,并有效干扰WRD细胞中p53 mRNA和蛋白表达,同时成功筛选并建立p53RNAi慢病毒稳定感染WRD/p53-细胞系。
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关 键 词: | p53 RNA干扰 慢病毒载体 WRD细胞 |
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