RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活

目的利用慢病毒干涉下调内源性RNF31 表达，研究NF-κB通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法将人RNF31 的
shRNA片段克隆到慢病毒表达载体pGreenPuro中，瞬时转染HEK293T细胞，筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装
质粒PMD、SPA共转染293T 细胞，在24 h、48 h 分2 次收集慢病毒上清，用流式细胞术检测病毒滴度。将获得的病毒感染
HEK293细胞，提取细胞蛋白，Real-time PCR以及Western Blot 检测RNF31干涉效果；报告基因实验检测敲低RNF31对NF-κB
转录活性的影响；Real-time PCR检测干涉RNF31对TNF-α诱导的NF-κB下游靶基因的影响；Western Blot 检测下调RNF31对
IκBα活化的影响；Hochest染色检测下调RNF31对细胞凋亡的影响。结果成功构建RNF31干涉慢病毒pGreenPuro-RNF31载
体并获得慢病毒颗粒，病毒滴度可达3×107 pfu/ml。在HEK293细胞中下调RNF31，抑制TNF-α刺激的NF-κB的转录活性，并抑
制NF-κB下游靶基因的表达；下调RNF31抑制TNF-α刺激的IκBα的活化；此外，在TNF-α刺激细胞24 h时，RNF31表达下调使
细胞凋亡增多。结论RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活。